納米技術(shù)因優(yōu)良理化性質(zhì)，已廣泛應用于醫(yī)學、電子、食品等多個領域，但大規(guī)模生產(chǎn)與使用增加了人類對納米材料（NMs）的暴露風險，其對人體健康和環(huán)境的潛在不利影響催生了納米毒理學這一學科。然而納米材料具有異質(zhì)性，且缺乏標準化評估技術(shù)，從而導致傳統(tǒng)檢測方法（如比色法、常規(guī)流式細胞術(shù)（FC））易受納米材料特異性干擾，產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果；且常規(guī)流式細胞術(shù)需進行細胞標記，進一步增加了納米材料與試劑、熒光物質(zhì)相互作用的干擾風險。這些干擾具有顆粒、濃度和檢測方法的特異性，需單獨優(yōu)化，使得納米毒性檢測難度大、耗時且成本高昂。因此，亟需開發(fā)無干擾的一線篩選方法，即在研發(fā)早期識別有毒納米材料及對應的濃度、時間節(jié)點的篩選方法，進而為后續(xù)機制研究提供線索，從而節(jié)省人力和財力資源。
Ampha Z32非標記微流控阻抗流式細胞儀（IFC法）與現(xiàn)有檢測手段的不同之處在于，它能夠通過寬頻率范圍對單個細胞的電學特性進行高通量測量。其可同時在多個頻率下進行單個細胞大小、膜特性和細胞內(nèi)特性的檢測以深入了解細胞狀態(tài)。無標記特性意味著細胞在檢測前不會被化學試劑修飾或經(jīng)過復雜處理。重要的是在納米毒性測試中，這一特性還能顯著降低納米材料誘導干擾的可能性。
本研究從一線篩選方法的角度，結(jié)合納米材料可能引發(fā)的干擾，評估了Ampha Z32非標記微流控阻抗流式細胞儀（IFC法）在體外納米毒性測試中的適用性。此外，該項研究還以U937人淋巴瘤細胞為模型，將其暴露于8種OECD參考納米材料（二氧化鈦（TiO?）NM-100和NM-101、二氧化硅（SiO?）NM-200和NM-203、氧化鋅（ZnO）NM-110和NM-111、銀（Ag）NM-300K和NM-302），進而對IFC檢測方法進行了優(yōu)化和標準化，并將其可靠性與兩種傳統(tǒng)檢測方法（臺盼藍染色排除法和傳統(tǒng)流式細胞儀）進行了對比。
Ampha Z32（IFC法）在納米材料毒性檢測中的適用性
不同檢測緩沖液下Ampha Z32（IFC法）對U937細胞的檢測效果
不同檢測頻率下，失活細胞（綠色）與活性細胞（紅色）的分離（IFC法）
利用Ampha Z32（IFC法）可實現(xiàn)活細胞、壞死細胞及小型校準微球的分離
通過Ampha Z32（IFC法）檢測的NM-300K（Ag，100μg/ mL）對U937細胞的急性毒性效應。活細胞（紅色），暴露在NM-300K中10min（藍色），暴露在NM-300K中30min（紫色）和壞死細胞（綠色）
研究結(jié)果表明，Ampha Z32非標記微流控阻抗流式細胞儀（IFC法）在所有測試中均未檢測到納米材料的相關信號，也就是說所測試的8種具有不同化學組成、大小、形狀和表面涂層的金屬和金屬氧化物納米材料，均未對Ampha Z32的檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾。此外，Ampha Z32還檢測到了NM-300K（Ag，100μg/ mL）對U937細胞產(chǎn)生的急性毒性效應，可見Ampha Z32非標記微流控阻抗流式細胞儀（IFC法）具有無標記的特點，不易受納米特異性干擾，是一種有效、環(huán)保且可靠的納米材料誘導毒性檢測工具。
Ampha Z32（IFC法）的可靠性
劑量反應曲線（TB&IFC）?；疑摓殛幮詫φ眨唇】导毎钠骄怠癝E”（%）。與對照組（0μg/ml）相比，單次方差分析（n≥3）結(jié)果顯示，毒性效應具有統(tǒng)計性意義（P ≤ 0.05、**P ≤ 0.01和**P≤ 0.001）
Ampha Z32（IFC法）與Countess（TB染色法）對8種納米材料的劑量-反應曲線表明，兩種檢測方法的檢測結(jié)相關性極高（R2值接近1），且Ampha Z32單次樣本可分析10000-20000個細胞，遠多于TB染色法（200-300個），因此能更精準反映納米材料的毒性效應。此外，經(jīng)參數(shù)優(yōu)化后（6MHz、緩沖液（PBS: 0.28M蔗糖= 1:4）、0.02Vtrigger level(V)）后，Ampha Z32不僅可以清晰區(qū)分活細胞、壞死細胞及不同尺寸顆粒，還能檢測細胞死亡早期階段（凋亡），比TB染色法更靈敏。
傳統(tǒng)流式細胞儀（FC，左）& Ampha Z32（IFC，右）測量結(jié)果對比。陰性對照（未暴露細胞，紅色）、陽性對照（加熱處理細胞，綠色）和TNF-α/CHX + NM-100處理組（藍色）
盡管Ampha Z32（IFC法）與Countess（TB染色法）的檢測結(jié)果一致，但Ampha Z32（IFC法）和傳統(tǒng)流式細胞儀（BD LSR Fortessa）的檢測結(jié)果卻存在較大差異，這是由于傳統(tǒng)流式細胞儀（FC）易受納米材料特異性干擾。例如NM-100（TiO?納米顆粒）會與FC染色劑或讀數(shù)系統(tǒng)相互作用，導致凋亡誘導劑（TNF-α/CHX）處理組的活細胞群體（Annexin-V?/7-AAD?）被高估，導致活力數(shù)據(jù)嚴重偏離真實值。同時納米材料還會吸附染料、充當熒光猝滅劑/增強劑，或散射/吸收光線，直接干擾光學信號的準確性。而Ampha Z32（IFC法）基于細胞阻抗信號（電阻+電抗）分析細胞狀態(tài)，無需熒光染料或化學標記。納米材料不會與阻抗檢測的電學信號產(chǎn)生相互作用，僅細胞自身狀態(tài)（膜完整性、大小等）影響檢測結(jié)果，無額外干擾源，該研究團隊在近期的研究中已將其成功應用于骨再生支架用納米金剛石（非金屬納米材料）的毒性評估中，可見Ampha Z32（IFC法）在體外納米毒性評估中具有優(yōu)勢顯著。
與許多傳統(tǒng)檢測方法相比，Ampha Z32（IFC法）不使用有毒或?qū)Νh(huán)境有害的試劑，更具環(huán)保性，可輕松適配于評估更大顆粒、化學品和藥物的效應，是一種可靠性，是穩(wěn)定、可信的細胞活力評估工具，不僅可作為納米毒性一線篩選的優(yōu)選方法，尤其適用于作為活力檢測的一線篩選工具。 Ampha Z32 已升級為 Ampha X30，其針對從微小細菌、藻類、酵母到大型哺乳動物細胞等各類樣本，預設了最佳測試模板。設備內(nèi)置程序化沖洗功能，每個樣本檢測后自動執(zhí)行沖洗，既防止芯片與管路堵塞，更能避免樣本殘留引發(fā)的交叉污染，操作與維護更便捷。
原文：Ostermann, M., Sauter, A., Xue, Y. et al. Label-free impedance flow cytometry for nanotoxicity screening. Sci Rep 10, 142 (2020).