隨著全球氣候變化，可能會加劇作物疾病的爆發(fā)，如水稻的稻曲病。稻曲病（RFS）是由活體營養(yǎng)型病菌Ustilaginoidea virens（U. virens）引起的水稻穗部真菌病害，在全球范圍內(nèi)的水稻產(chǎn)區(qū)內(nèi)廣泛存在，目前防治這一疾病的戰(zhàn)略主要依賴于使用合成殺菌劑，這會對環(huán)境和人類健康構(gòu)成潛在風(fēng)險，利用植物微生物群防治已成為促進植物健康和控制疾病的可持續(xù)方法。寄主植物與其微生物群之間的互惠作用可提供抗病性，這種相互作用的研究一般集中在根際微生物之間，植物地表的微生物群如何提供抗病性仍不清楚。浙江大學(xué)農(nóng)學(xué)院王蒙岑課題組在植物抗病防御機制上取得新成果，近期在微生物領(lǐng)域國際著名期刊《Nature Microbiology》發(fā)表了“Phyllosphere microbiome induces host metabolic defence against rice false-smut disease”的研究論文。入選《Nature Reviews Microbiology》研究亮點（鏈接：https://doi.org/10.1038/s41477-023-01470-5）。該成果解析了宿主植物與穗部微生物互作防御病原菌侵染的作用機制。該研究通過整合微生物群落多樣性測序，初級代謝分析，真菌毒素的定性定量分析、宿主基因組編輯、微生物移植試驗和生化、遺傳學(xué)等技術(shù)手段，發(fā)現(xiàn)具有穗部核心菌群的植物以抑制支鏈氨基酸（BCAAs）依賴性方式來防御稻曲病菌的侵染，且田間試驗表明，亮氨酸與50%殺菌劑聯(lián)合使用實現(xiàn)高濃度殺菌劑的防治效果。在RFS爆發(fā)期間，該團隊發(fā)現(xiàn)同一水稻品種在同一地點的相鄰田塊出現(xiàn)發(fā)病與抑病兩種相反的穗部性狀。發(fā)病植株（DPs）和抗病植株（DSPs）兩個地塊的U. virens主要侵染源的種群密度無差異，進一步分析發(fā)現(xiàn)了發(fā)病和抑病植物的根際微生物群落組成和多樣性無差異。在對穗部微生物群落分析時，抗病植株上發(fā)現(xiàn)了獨特的穗部微生物群落，發(fā)病植株的穗部細菌群落豐度顯著高于抑病植株，但多樣性相反（圖1a，b），在真菌群落上，抑病植物的豐度和多樣性顯著高于發(fā)病植物（圖1d，e），基于Beta多樣性的主坐標分析(PCoA)進一步揭示了這種差異（圖1c，f）。對優(yōu)勢真菌分析，發(fā)病植株中為綠核菌屬和鐮刀菌屬，抑病植株中依次為曲霉、黑孢屬和莫氏黑粉菌屬（圖1g）。在細菌屬上，乳酸桿菌和萊夫森菌是抑病植物所特有的（圖1h）。微生物共生網(wǎng)絡(luò)各種特征均相似，因此假設(shè)獨特的穗部微生物群與宿主相互作用，從而對疾病抑制產(chǎn)生影響。
圖1 水稻發(fā)病株和抑病株的穗部微生物組分析為分析水稻穗部的獨特微生物群落的宿主的相關(guān)性，對發(fā)病株和抑病株的穗部局部代謝進行分析。其中總蛋白和可溶性糖沒有顯著差異（圖2 a，b），但亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸在內(nèi)的支鏈氨基酸在抗病植物的穗中顯著富集（圖2c）。通過穗部真菌毒素的定性和定量分析來研究外源代謝線索，在發(fā)病株中檢測出稻曲病菌毒素包括A、B、C、D和F，呈下降趨勢，抑病株中的稻曲病菌毒素A含量極低（圖2d）。進一步分析結(jié)果表明，稻曲病菌毒素A的積累與15種氨基酸呈正相關(guān)，與支鏈氨基酸呈負相關(guān)（圖2 e，f），其中與在穗部的優(yōu)勢支鏈氨基酸亮氨酸的高度負相關(guān)。該研究接下來主要關(guān)注改變的支鏈氨基酸這個獨特的代謝線索。
圖2 微生物群落結(jié)構(gòu)特異性的水稻穗的局部代謝圖譜為進一步分析微生物群落與支鏈氨基酸之間的相互作用，對抑病株穗部的微生物進行分離，獲得了2357個微生物分離株，其中31個株具有抑病能力。對這些具有抑病能力的分離株進行鑒定并分類為11個屬，還推斷出在抑制疾病的植物的穗部顯著富集的微生物類群（圖3 a，b）。從抑制疾病的關(guān)鍵微生物類群，選取6株具有最高抑病率（>80%）的微生物分離株，分析它們與支鏈氨基酸的關(guān)系及抑病意義。實驗結(jié)果表明，關(guān)鍵類群成功定植后穗部的亮氨酸水平明顯升高（圖3c）。且隨著亮氨酸水平的升高，BCAA轉(zhuǎn)氨酶基因（OsBCAT）的表達量在穗中受到抑制（圖3d）。
圖3 支鏈氨基酸、微生物群和水稻穗部疾病抑制之間相互作用解析利用CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)，該團隊在水稻中成功獲得了OsBCAT突變體，突變體的OsBCAT基因和蛋白序列如圖（圖3 e-g）。與野生型（WT）相比，OsBCAT突變體（Osbscat）的穗部亮氨酸水平明顯增加，表明OsBCAT負調(diào)控水稻穗部BCAA水平（圖3 h）。且與野生型相比，Osbcat突變體對U. virens的抗性顯著增加，外源亮氨酸的補充和高抑病能力菌株的定植也使得WT對U. virens的抗性增加（圖3 i），但關(guān)鍵分類群定植沒有進一步增加的Osbcat突變體的抑病能力，說明水稻穗部中微生物群介導(dǎo)的疾病抑制是依賴于BCCAs的。為了闡明BCAAs抑制U. virens感染的具體作用模式，該團隊研究了BCAAs抑制U. virens引起的水稻穗部RFS發(fā)病的劑量依賴性效應(yīng)，結(jié)果表明，亮氨酸以劑量依賴性的方式抑制了U. virens稻曲球的形成（圖4 a-f）。此外田間試驗，亮氨酸與化學(xué)殺菌劑聯(lián)用在減少了50%的殺菌劑用量下獲得了良好的防治效果。在體外培養(yǎng)實驗中，亮氨酸對U. virens菌絲體生長的抑制作用呈劑量依賴性（圖4 g）。通過光學(xué)顯微鏡、電鏡和相機觀察發(fā)現(xiàn)暴露在亮氨酸條件下的U. virens在微觀尺度(圖4 h-m)和宏觀尺度(圖4 n-r)上都出現(xiàn)了明顯的形態(tài)學(xué)缺陷。共聚焦檢測結(jié)果顯示在亮氨酸暴露條件下的U. virens的細胞核中觀察到濃縮的染色質(zhì)（圖4 1,m），這說明發(fā)生了凋亡樣細胞死亡，流式細胞儀檢測，定量分析，DNA Ladder和DNA片段的跑膠均證實了這種凋亡性細胞死亡現(xiàn)象（圖4 s-w)。綜上所述，升高的BCAAs導(dǎo)致了U. virens細胞功能障礙，從而抑制了穗中的RFS。
圖4 支鏈氨基酸暴露下條件下U. virens細胞功能失調(diào)的表征該研究進一步通過RNA-seq分析確定了暴露于亮氨酸后U. virens轉(zhuǎn)錄組的全局變化。結(jié)果表明，BCAAs誘導(dǎo)了U. virens的轉(zhuǎn)錄組重編程，511個基因在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生了差異表達。通過GO通路富集分析表明，U. virens中被抑制的轉(zhuǎn)錄本主要參與真菌毒素生物合成、效應(yīng)物、病原體-宿主相互作用和假設(shè)的致病性相關(guān)基因等過程（圖5 a，b），也存在與細胞凋亡樣細胞死亡相關(guān)的差異表達基因（圖5 c），如U. virens中顯著上調(diào)的丙酮酸代謝基因（UvKm1），抗氧化劑相關(guān)基因（UvATO2）和顯著下調(diào)的氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運基因（UvAaT1）。此外觀察到U. virens中l(wèi)-氨基酸氧化酶編碼基因（UvLAO2）的表達量顯著增加。此外，該研究發(fā)現(xiàn)H2O2外源處理可誘導(dǎo)U. virens細胞凋亡樣死亡，而抑制細胞內(nèi)H2O2過量產(chǎn)生可顯著降低U. virens細胞凋亡樣死亡率（圖 5f），這些結(jié)果闡明了過量產(chǎn)生的H2O2在凋亡樣細胞死亡中的重要作用。該研究已經(jīng)觀察到這些H2O2引起的U. virens細胞凋亡樣死亡的標記基因UvLAO2。靶向敲除UvLAO2后，U. virens中ΔUvlao2相比于野生型，H2O2積累顯著減少，水稻穗上的致病性增強，對亮氨酸的敏感性降低（圖5 g-h）。因此，UvLAO2介導(dǎo)的H2O2過量產(chǎn)生參與了BCCAs誘導(dǎo)的U. virens細胞功能障礙。更為有趣的是其他BCAAs，包括纈氨酸和異亮氨酸，也結(jié)合到UvLAO2相同的結(jié)構(gòu)域，但親和與作用位點不同（圖5 i）。且纈氨酸和異亮氨酸具有一定的誘導(dǎo)H2O2積累和抑制U. virens感染的功能。綜上所述，UvLAO2負向調(diào)節(jié)了U. virens的致病性，UvLAO2介導(dǎo)的H2O2過量產(chǎn)生是BCAA抑制U. virens在穗部感染的原因。
圖5 U. virens中亮氨酸誘導(dǎo)的細胞功能障礙的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析該成果破譯了宿主植物與穗部微生物聯(lián)合防御病原菌侵染的分子機制，闡明了作物病害控殘減毒防控技術(shù)的新靶點，為作物抗病品種的分子設(shè)計改良提供了新資源。—— 參考文獻 ——
Liu, X., Matsumoto, H., Lv, T, et al. Phyllosphere microbiome induces host metabolic defence against rice false-smut disease[J]. Nature Microbiology, 2023.
Agripheno?高通量基因分型檢測平臺包括高通量Oktopure DNA提取儀、Nexar?模塊化內(nèi)聯(lián)液處理與分析系統(tǒng)、Soellex?高通量PCR水浴熱循環(huán)系統(tǒng)和Araya?內(nèi)聯(lián)熒光檢測系統(tǒng)。Oktopure DNA提取儀采用磁珠的方法提取DNA，通量達到800個樣本/3小時。同時，適用于多種樣本類型的DNA提取，包括植物葉片、種子，毛發(fā)、血方卡、精液、口拭子、唾液、組織等。提取的DNA適用于多種下游應(yīng)用，如基因分型、一代測序、二代測序等。Nexar高通量吸取樣品DNA和引物、mix至384孔卷帶并封膜。Soellex對封膜完成的卷帶進行PCR水浴熱循環(huán)，每次最多可達230,000個樣本。Araya對水浴完成的卷帶掃描分析，28秒掃描一張卷帶。Agripheno?基因分型采用KASP（Kompetitive Allele Specific PCR）原理，對目標SNPs和InDels進行精準的雙等位基因分型。反應(yīng)體系僅1.6μl，具有高通量、低成本，準確率和檢出率接近100%的明顯優(yōu)勢。
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根據(jù)目標DNA/基因序列,可開發(fā)高效的分子標記（SNP-KASP、SSR等），并可實現(xiàn)單日最高一萬SSR數(shù)據(jù)點，以及數(shù)以十萬計的SNP數(shù)據(jù)點檢測。
基因組育種芯片是將大規(guī)模的基因組測序、功能基因組研究的最新成果與國際最先進的SNP芯片技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建的服務(wù)于育種的基因組技術(shù)工具。目前，種業(yè)芯片檢測平臺，可以提供依托于Affymetrix基因芯片平臺的固相芯片檢測服務(wù)（如Maize-6H60K、Maize-6H90K、Soybean-180K等）、以及依托于華大智造MGISEQ-2000檢測平臺的液相芯片檢測服務(wù)。
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GenoPlex基于多重PCR的靶向基因捕獲技術(shù)方案
GenoBaits基于液相探針雜交的靶向基因捕獲技術(shù)方案
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