有活力的花粉是植物成功繁育的基本要素之一，也是形成種子的先決條件。能夠長期保存有活力的花粉可為農(nóng)業(yè)、林業(yè)和園藝領(lǐng)域創(chuàng)造育種和生產(chǎn)的靈活性，并實現(xiàn)跨越地理和季節(jié)限制的有效雜交，從而減少在授粉過程中雌雄植株同步開花的協(xié)調(diào)工作并確保授粉花粉的可用性。茄科植物花粉冷凍保存是全世界雜交種子生產(chǎn)行業(yè)的普遍做法，集中進行花粉生產(chǎn)對于確保知識產(chǎn)權(quán)、降低多年種子生產(chǎn)計劃中的雌雄比例以及花粉生產(chǎn)風險管理等戰(zhàn)略來說具有特別重要的意義。
花粉冷凍保存通常包括脫水、冷卻、儲存、解凍和再水合這一系列過程，每個過程的出錯會嚴重影響最終的花粉質(zhì)量，尤其是在工藝條件不理想的情況下，因此，監(jiān)測花粉供應鏈上各個環(huán)節(jié)的花粉質(zhì)量是十分必要的。目前，育種者和種子生產(chǎn)商已將花粉活力檢測作為一種風險管理工具，以防止低質(zhì)量授粉而導致的產(chǎn)量損失。
傳統(tǒng)上進行花粉活力的評估多以顯微鏡為基礎，如通過顯微鏡觀察花粉大小的變化、熒光或非熒光染料染色后花粉新陳代謝活動或膜的完整性、萌發(fā)率以及花粉管的生長情況，此類檢測中的數(shù)據(jù)分析通常通過人為量化細胞亞群或使用圖像處理軟件工具來完成。近些年，該領(lǐng)域逐漸引入了庫爾特計數(shù)器和阻抗流式細胞儀（IFC），如瑞士Amphasys公司的Ampha Z32阻抗流式細胞儀就是專為分析花粉質(zhì)量而研發(fā)的設備，其原理是通過檢測流經(jīng)微流控芯片的單個花粉粒的電阻抗特性來區(qū)分花粉活力。對比勞動強度、分析和動手耗時、結(jié)果可靠性、標準化程度和測試成本等方面，所有這些技術(shù)都各有優(yōu)缺點。
本研究通過IFC活力法、體外萌發(fā)法以及花粉管長度分析，檢測了同一批冷凍保存下的番茄和辣椒花粉樣本，并對三種花粉質(zhì)量分析方法進行了評估，以確定其是否適用于冷凍保存下的花粉的常規(guī)質(zhì)量控制。結(jié)果表明：
i. Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC活力法）得到的花粉活性可以解釋為花粉的發(fā)芽潛力，而體外萌發(fā)法則可在給定的發(fā)芽條件下直接量化花粉的發(fā)芽潛能，兩種分析方法之間存在線性相關(guān)；
ii. 對自動化程度、通量、可重復性和再現(xiàn)性要求高的應用和行業(yè)來說，IFC活力法的理想的檢測工具；
iii. 由于難以實現(xiàn)標準化，體外萌發(fā)法只適用于有一定時間和地域限制的研究；
iv. 由于通量低且可重復性差，通過花粉管長度分析花粉活性不能充分滿足行業(yè)需求。
IFC數(shù)據(jù)與顯微鏡鏡檢數(shù)據(jù)的相關(guān)性
表1 花粉粒的不同形態(tài)亞型
分類 | 描述 | 圖示 |
Aberrant 異?；ǚ?/span> | 異常細胞與小孢子發(fā)育的中止有關(guān)，例如由于熱脅迫導致的敗育 |
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Aberrant 脫水花粉 | 這些花粉再水合并懸浮于萌發(fā)緩沖液中后，不能在形態(tài)上重建?？梢郧宄乜吹筋愃?"咖啡豆 "的溝紋。 |
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Reconstituted, not germinated | 這類花粉粒通過再水合并懸浮在發(fā)芽緩沖液中，在形態(tài)上得以重組，但沒有形成花粉管，如圖1a–II |
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Reconstituted, pollen tube emerging | 這些花粉粒形成了花粉管，但花粉管的長度短于花粉的直徑 |
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Reconstituted, pollen tube longer than pollen diameter | 這些花粉粒形成了花粉管，但花粉管的長度短于花粉的直徑 |
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圖1 a. 顯微鏡下冷凍番茄花粉再水合過程中的形態(tài)重建（比例尺=50μm）：a-I)冷凍保存的番茄花粉，呈溝狀形態(tài)；a-II）在95-99%相對濕度下再水合30min后的番茄花粉，重建為更球形的形態(tài)；b. IFC火力法可量化不同類型的茄科花粉：圖上每個點對應一粒花粉，通過分析可在相位-振幅散點圖中設置門控區(qū)分活化粉粒、死花粉粒和異?；ǚ哿＃籧 .番茄花粉類群的量化：百分比柱狀堆積圖：顯微鏡鏡檢法；散點圖：IFC活力法d. 辣椒和番茄花粉的樣品活性（IFC活力法）與形態(tài)可重建花粉占比（顯微鏡鏡檢）的相關(guān)性分析。
IFC活力法vs.體外萌發(fā)法vs.花粉管長度分析
圖2 IFC活力法、體外萌發(fā)法、花粉管長度分析三種花粉質(zhì)量評估的比較
荷蘭和瑞士兩個試驗點的20個樣品的檢測結(jié)果表明，IFC活力法與體外萌發(fā)法之間有很強的正相關(guān)性（圖2a，番茄R2=0.77，辣椒R2=0.87）。其中，番茄和辣椒的體外萌發(fā)率分別比IFC活力平均低26%和19%。IFC活力和花粉管長度之間也存在正相關(guān)性，表明質(zhì)量較高的花粉批次往往含有更多活力更強的花粉，從而形成更長的花粉管（圖2b）。體外發(fā)芽率與花粉管長度間也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果（圖2c）。
不同測量方法的再現(xiàn)性和重復性
IFC法的再現(xiàn)性非常高，花粉活性平均偏差為5%（圖3a），可重復性強；體外萌發(fā)法再現(xiàn)率略低，平均偏差為9%，可重復性中等；花粉管進行活力評估的結(jié)果差異較大，重復性較差。
圖3 不同試驗方法的再現(xiàn)性和重復性
圖4 發(fā)芽培養(yǎng)基滲透壓對離體番茄花粉發(fā)芽率和花粉完整性的影響。高滲透壓緩沖液降低了發(fā)芽率和花粉破裂的風險（比例尺 = 100 μm）。
本次研究結(jié)果表明，體外萌發(fā)法和IFC活力法均適用于分析冷凍保存的番茄和辣椒花粉的活性，且二者間具有高度的線性相關(guān)性。但值得注意的是，體外萌發(fā)法需要測試者嚴格遵循標準化測試方案，這包括緩沖液配方、測定溫度和萌發(fā)時間，并明確不同花粉形態(tài)和發(fā)芽水平分類標準，相較而言，其更適用于特定研究地點的短期實驗；而IFC活力法是一種可在任意地點由任何用戶進行標準化操作的高通量檢測方法，更適用于涉及操作人員和實驗地點多、需要在更大時間窗口進行數(shù)據(jù)對比的測試項目中。
—— 參考文獻 ——
Langedijk, N.S.M., Kaufmann, S., Vos, E. et al. Evaluation of methods to assess the quality of cryopreserved Solanaceae pollen[J]. Sci Rep 13, 7344 (2023).
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