單倍體育種作為育種的核心生物技術(shù)之一，具有快速純合基因、縮短育種年限、提高育種效率等優(yōu)勢。這項(xiàng)技術(shù)是基于對處于發(fā)育特定階段的小孢子在進(jìn)行脅迫處理，可使小孢子的配子體途徑發(fā)生重編程轉(zhuǎn)向孢子體途徑，從而產(chǎn)生胚胎。在整個(gè)發(fā)育過程中，雄配子體誘導(dǎo)的產(chǎn)胚率受許多因素的影響，如供體植株的質(zhì)量和生理狀態(tài)、自身基因型、小孢子發(fā)育階段、脅迫誘導(dǎo)預(yù)處理和培養(yǎng)條件等，因此如何提高雄配子體誘導(dǎo)的產(chǎn)胚率是這項(xiàng)技術(shù)成功的關(guān)鍵。
在過去十年中，研究者通常利用染色法和顯微鏡鏡檢來研究小孢子胚性發(fā)育并進(jìn)行產(chǎn)胚量的預(yù)測，由于染色法不具備通用性，不同的物種需要選擇不同的染色劑，導(dǎo)致整個(gè)測試過程繁瑣且費(fèi)時(shí)、耗力。因此，亟需一種可以簡單、快速、可靠檢測小孢子胚性發(fā)育階段的無創(chuàng)檢測工具。有研究報(bào)道，Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀（IFC）基于細(xì)胞介電特性可檢測細(xì)胞的大小及活性，已應(yīng)用于細(xì)菌活性、酵母大小，腫瘤細(xì)胞的分化、凋亡和壞死等多項(xiàng)研究中。本研究利用Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀（IFC），進(jìn)行了：（i）離體培養(yǎng)細(xì)胞活力的常規(guī)監(jiān)測；（ii）脅迫處理效率的測定；（iii）小孢子懸浮液中產(chǎn)胚量的早期預(yù)測，探討了小麥小孢子離體培養(yǎng)過程中發(fā)生不同發(fā)育途徑的可能性。研究表明，IFC技術(shù)可以很好的描述細(xì)胞懸浮液中所有小孢子的發(fā)育途徑，包括胚性小孢子和花粉小孢子，可以簡單快速準(zhǔn)確的評估脅迫處理的效率，并在小麥雄核發(fā)育的早期（離體培養(yǎng)的前7天內(nèi)）進(jìn)行產(chǎn)胚量的可靠預(yù)測。圖1 IFC法判別小孢子懸浮液（培養(yǎng)1天）中活細(xì)胞和死細(xì)胞
（A）為熱處理后小孢子懸浮液散點(diǎn)圖；（B）為未處理小孢子懸浮液散點(diǎn)圖；振幅代表細(xì)胞大小，相位角代表細(xì)胞活性；（C）為IFC法與染色法相關(guān)性比較（P＜5；=0.9922，n=15）
圖2 Pavon小麥配子體和孢子體途徑的發(fā)育階段（IFC法）配子體途徑：ML：單核中晚期；EB：早期雙核；LB：單核晚期；ET：三核早期；LT：三核晚期。孢子體途徑：顯示了培養(yǎng)前21天、培養(yǎng)第0、1、5和7天的小孢子發(fā)育狀態(tài)。ML/D-21代表配子體發(fā)育和孢子體發(fā)育的共同階段，紅色垂直門控右側(cè)為活性細(xì)胞，藍(lán)色多邊形門控P1為雄核發(fā)育開始時(shí)的活性孢子群；綠色多邊形門控P2為孢子離體培養(yǎng)前（D0）的活性孢子群；紫色多邊形門控P3為離體培養(yǎng)1天后的活性孢子群。P1、P2、P3三個(gè)孢子群精準(zhǔn)描繪出雄核發(fā)育過程的三個(gè)階段。圖3 Pavon小麥配子體和孢子體途徑的發(fā)育階段（顯微鏡）熒光DAPI染色后，使用可見光顯微鏡觀察小孢子：（A）單核小孢子；（B）雙核小孢子；（C）花粉粒；（D）星形小孢子（v為液泡）；（E）多核小孢子；（F）質(zhì)膜化小孢子。比例尺＝20μm。圖4 P1、P2、P3三個(gè)小孢子類群的振幅和相位角中值數(shù)本次實(shí)驗(yàn)分別在培養(yǎng)前21天、培養(yǎng)第0天和第5天用IFC法檢測了不少于5個(gè)小孢子懸浮液，并分別分析了每個(gè)懸浮液中P1、P2和P3類群中小孢子的活性（振幅A圖）和大小（相位角B圖）。每個(gè)點(diǎn)代表每個(gè)類群內(nèi)小孢子的數(shù)量。Tukey檢驗(yàn)表明，不同培養(yǎng)天數(shù)下，不同類群內(nèi)的孢子數(shù)量沒有顯著變化（p<0.05），進(jìn)而說明IFC法可以精準(zhǔn)描繪出雄核發(fā)育過程。圖7 Pavon小麥小孢子培養(yǎng)早期的產(chǎn)胚量預(yù)測（IFC法）本實(shí)驗(yàn)利用培養(yǎng)第7天的小孢子懸浮液中P3類群的小孢子的存活率并與產(chǎn)胚量進(jìn)行了相關(guān)性分析，所得線性方程為：y=6.539x-20.827；=0.9519，p<0.05 。結(jié)果表明，IFC法可以在小孢子培養(yǎng)早期進(jìn)行產(chǎn)胚量的準(zhǔn)確預(yù)測。綜上所述，Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀（IFC）是一個(gè)能夠簡單快速追蹤小孢子的發(fā)育狀態(tài)、評價(jià)脅迫處理效率、進(jìn)行產(chǎn)胚量早期預(yù)測的可靠測量工具。
案例介紹視頻：Customer Success Story: Embryo Yield Prediction in Microspore Culture，密碼: 0?5cD+fe
Canonge J, Philippot M, Leblanc C, et al. Impedance flow cytometry allows the early prediction of embryo yields in wheat (Triticum aestivum L.) microspore cultures. Plant Science, 2020, 300: 110586.
